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Drittmittelprojekt

Titel:
Bedeutung eines Wachstumsfaktors für neuronale Funktionen TP: Identifizierung neuer Bindepartner für GDF5/MP52; Charakterisierung des Signalweges von GDF5/MP52 mittels Reportergen-Analysen.

Projektleitung an der Universität Würzburg:

Beteiligte Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler:

Kurzbeschreibung:
In unseren bisherigen Arbeiten haben wir uns mit der Signaltransduktion verschiedener Mitglieder der TGF-ß Superfamilie beschäftigt (TGF-ß1, -ß2, -ß3, BMP-2, -4 und -7), vor allem dem initialen Schritt der Rezeptor- Oligomerisierung über die jeweiligen Liganden. Im Zuge dieser Arbeiten haben wir Bindungstests sowohl für die TGF-ß's als auch BMP's, in neueren Arbeiten auch für GDF5/MP52 etabliert. Nach Bindung und chemischem Quervernetzen von jodiertem GDF5/MP52 ist es uns gelungen, Bindepartner, vermutlich Zelloberflächen Rezeptoren, in verschiedenen Zellinien sichtbar zu machen. Unser Ziel ist es nun, die cDNA für diese Rezeptoren und weitere GDF5/MP52 Signalmoleküle mittels unterschiedlicher Methoden zu klonieren. Dazu soll zunächst von Zellinien, die im erwähnten Bindungstest positive Resultate aufwiesen eine cDNA-Bank hergestellt werden, die später für Expressionsklonierungsexperimente in Cos-Zellen verwendet werden kann. Dabei erwies sich die Zellinie ROB-C26 als äusserst interessant, da sie sowohl im Bindungstest als auch bei biologischen Tests, die wir mittels Reportergen-Analysen durchführten, positive Signale ergab. Diese Klonierungsmethode basiert ausschliesslich auf Bindung und chemischem Quervernetzen des von der Firma BIOPHARM rekombinant hergestellten GDF5/MP52. Um weitere Signalmoleküle zu identifizieren, soll der in unserem Labor etablierte Reportergentest verwendet werden. Im Rahmen dieses Vorhabens ist geplant, GDF5/MP52- responsive und nicht-responsive Zellinien zu identifizieren, und eine den Reporter stabil-exprimierende nicht-responsive Zellinie herzustellen. Durch Transfektion dieser stabilen Zellinie mit der Expressions cDNA- Bank und einer sich anschliessenden Selektion GFP-positiver Zellen (der Reporter enthält Smad-Bindungsstellen upstream des GFP) nach Zugabe von GDF5/MP52 soll die cDNA für GDF5/MP52-Signalmoleküle identifiziert werden. Ein derart etabliertes Screeningmodell ist ebenfalls für weitere Mitglieder der TGF-ß Superfamilie (z.B. GDF-15) denkbar. Die geplanten Experimente, Bindungstests und Reportergen-Analysen an verschiedenen Zellinien, Herstellen der c-DNA-Bänke und Herstellen stabiler Zellinien sind aller Voraussicht nach mit der beantragten Personal- und Sachmittel-Ausstattung in 4 Monaten zum Abschluss zu bringen. Die Unterstützung der BIOPHARM, die GDF5/MP52 in den notwendigen Mengen rekombinant herstellen, ist für den Erfolg dieser Arbeiten unerlässlich.

Schlagworte:
    Expressionsklonierung
    Neurone
    GDF5
    BMP
    TGF-ß

Laufzeit: von 01.1999 bis 04.2000

Förderinstitution:
Bund ( Bundesministerium für Bildung, Wissenschaft, Forschung und Technologie, Bonn ) ,Genehmigungsdatum: 25.02.1999

Publikationen: