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Drittmittelprojekt

Titel:
Charakterisierung der dominant-negativen Mutante des Transforming Growth Factor-ß Typ II Rezeptors,

Projektleitung an der Universität Würzburg:

Beteiligte Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler:

Kurzbeschreibung:
Transforming growth factor-ß(TGF) ist ein multifunktionelles Zytokin, welches maßgeblich an der Regulation zahlreicher zellulärer Prozesse (u.a. Proliferation, Differenzierung, Apoptose) beteiligt ist. Die TGF-ß Signaltransduktionskaskade wird durch die Bindung des Zytokins an zwei Serin/Threonin Kinase Rezeptoren (TßRI und TßRII) initiiert. Hierbei erfolgt zunächst hochaffine Bindung von TGF-ß an TßRII, wodurch TßRI in einen hetero-oligomeren Rezeptorkomplex rekrutiert und anschließend durch TßRII transphosphoryliert wird. Die daraus resultierende Aktivierung des TßRI führt zur transienten Bindung und Phosphorylierung von cytoplasmatischen Signalmolekülen, den Smad-Proteinen. Die Smad-Proteine dissoziieren daraufhin vom Rezeptor, hetero-oligomerisieren mit Smad4 (DPC4) und translozieren in den Zellkern, wo sie die Transkription spezifischer Gene regulieren. Einige der TGF-ß Zielgene partizipieren in der Vermittlung der Wachstums-inhibierenden Wirkung von TGF-ß, indem sie Zellzyklus-Arrest hervorrufen.
Im Zuge der Transformation von Zellen bzw. der Tumorprogression tritt häufig TGF-ß?Resistenz auf, die in Aufhebung der Wachstums-Inhibition resultiert. Als Ursache dafür können mutante TGF-ß Rezeptoren oder eine Verringerung ihrer Oberflächenexpression genannt werden. In einem kutanen T-Zell-Lymphom konnte die erste dominant-negative TßRII-Mutante (TßRII-D404G) identifiziert werden, die den TGF-ß Signalweg dadurch blockiert, dass der Transport an die Zelloberfläche gestört ist.
Zur näheren Untersuchung des Wirkungsmechanismus dieser Rezeptormutante wurden mittels retroviraler Infektion verschiedene stabile Zellinien generiert, die den dominant-negativen Rezeptor unter der Kontrolle eines Doxycyclin-induzierbaren Promoters exprimieren.
Als Zielzellen für die retrovirale Infektion wurden zunächst RIb-L17 Zellen verwendet, die sich durch das Fehlen der TßRI Rezeptor-Expression auszeichnen. Im Anschluß an den retroviralen Gentransfer wurden Subklone aus Einzelzellen herangezogen und - mittels Bindung und Quervernetzung von radioaktiv markiertem Liganden - auf ihre Doxycyclin-induzierbare Rezeptorexpression getestet. Einer der Subklone (SK4) zeigte in Abhängigkeit von Doxycyclin eine strarke Oberflächenexpression der dominant-negativen TßRII Mutante, TßRII-D404G. Dass die als Transport-defizient charakterisierte Rezeptor-Mutante in RIb-L17 Zellen doch an der Zelloberfläche detektierbar ist, kann möglicherweise auf die TßRI-Defizienz in diesen Zellen zurückzuführen sein.
Als weiteres Zellsystem wurden Ratten Pheochromocytoma Zellen (PC12) Zellen mit verschiedenen Varianten des TßII transduziert. Neben dem wild-typischen TßRII und der bereits beschriebenen TßRII-Mutante, TßRII-D404G, wurde eine zusätzliche dominant-negative Variante des Rezeptors, deren cytoplasmatische Domäne bis auf wenige Aminosäuren deletiert wurde (TßRII-Dcyt), verwendet. Ähnlich wie in den RIb-L17-Zellen konnte auch hier nach Doxycyclin-Behandlung eine starke Expression des TßRII-D404G Rezeptors beobachtet werden. Aufgrund der geringen Menge an endogenen TGF-ß Rezeptoren in PC12 Zellen kann auch hier ein veränderter Mechanismus für den Transport der Rezeptoren an die Zelloberfläche postuliert werden. Durch Reportergen-Analysen konnte gezeigt werden, dass der TßRII-D404G Rezeptor trotz des Erscheinens an der Zelloberfläche, keine Weiterleitung eines TGF-ß induzierten Signals erlaubt. Weiterhin konnte im Vergleich mit dem wild-typischen Rezeptor gezeigt werden, dass sowohl TßRII-D404G als auch TßRII-Dcyt als dominant-negative Rezeptoren wirken (1)
Dominant negativ wirkende Rezeptoren müssen in der Lage sein, wildtypische Rezeptoren in responsiven Zellen aus den Signalling Rezeptor Komplex zu verdrängen. Deshalb haben wir neben den biologischen Tests (Reportergen-Analysen, Proliferationstests) stets biochemische Nachweise über Ko-Immunpräzipitationen durchgeführt, um die Assoziation der Rezeptoren zu untersuchen. In diesem Zusammenhang haben wir untersucht, ob TßRII und TßRII-B Rezeptormutanten, denen die cytoplasmatische Domäne des Rezeptors fehlt (TßRII-D-cyt/TßRII-B-D-cyt) in der Lage sind, mit den wildtypischen Rezeptoren zu interagieren. Dabei konnte festgestellt werden, dass verkürzte Rezeptoren instabilere Komplexe eingehen, was durch eine erhöhte Sensitivität gegenüber Detergenz deutlich wird. Diese Komplexe sind jedoch in der Lage dominant negativ zu wirken; d.h. TßRII-B-D-cyt wirkt inhibierend auf endogenen TßRII und TßII-B, TßRII-D-cyt wirkt inhibierend auf endogenen TßRII und TßRII-B (Rotzer et al., in Vorbereitung).
Aus diesen Arbeiten geht hervor, dass die Wirkung von dominant inhibierenden Rezeptormutanten abhängig vom Oligomerisierungsverhalten dieses Proteins ist. Dies kann u. U. in verschiedenen Zellen aufgrund unterschiedlicher Zusammensetzung von Rezeptoren zu unterschiedlicher Wirkung führen.

Schlagworte:
    Rezeptoren
    TGF-ß

Laufzeit: von 04.1999 bis 03.2002

Förderinstitution:
DFG ( GK 181 )

Publikationen: