Titel:
Arbeitsgruppe osteoinduktive Materialien
Projektleitung an der Universität Würzburg:
Beteiligte Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler:
Kurzbeschreibung:
Die Zusammenarbeit mit der Physiologischen Chemie II im Biozentrum der Universität (Leiter Prof. Dr. Sebald) bei der biologischen Charakterisierung von neuen BMP-Mutanten wurde weiter fortgesetzt. Insbesondere wurden in Göttinger Minischweinen Dosis-Wirkungs-Beziehungen unterschiedlicher BMP-Mutanten ermittelt. Ausgedehnte Unterkieferdefekte (Kontinuitätsresektionen von 5cm Länge) wurden mittels osteoinduktiver Implantate aus einem Kollagenträger und BMP-Mutanten binnen 4 Wochen zur knöchernen Abheilung gebracht und das knöcherne Regenerat radiographisch sowie histologisch charakterisiert.
An neuen computergestützten Methoden zur Histomorphometrie wurde weitergearbeitet und ein Verfahren etabliert, welches die strukturelle Charakterisierung von Knochen anhand von Mirkoradiographien oder Histologien gestattet. So konnte erstmals gezeigt werden, dass die induzierte Knochenneubildung in einer biomechanisch belasteten Region, wie dem Unterkiefer des Minischweines, direkt zu einem biomechanisch ausgerichteten Regenerat führt. Dieses weist peripher eine corticalis-ähnliche Struktur auf und ist vornehmlich aus Lamellenknochen aufgebaut und ist somit einem autologen Transplantat überlegen, welches ausgedehnten adaptiven Umbauvorgängen unterliegt.
Einen weiteren Schwerpunkt stellten Untersuchungen zu den knochenbildenden Eigenschaften von aus Knochenmark gewonnenen osteoblastenähnlichen Zellen dar.
Die über selektive Kulturbedinmgungen gewonnen Zellen wurden anhand ihrer Genexpressionsmuster für osteoblatsentypische Marker (ALP, OC, BMP-2, BMP-4, Koll.-Typ I) charakterisiert und die Genprodukte immunhistochemisch nachgewiesen. Die Implantation von besiedelten dreidimensionalen Kollagenträgern in die Oberschenkelmuskulatur von Nacktmäusen führte reproduzierbar zur Knochenneubildung.
Die in vitro-Langzeitkultivierung von osteoblastären Zellen in einer dreidimensionalen Matrix stellt nach wie vor eine Herausforderung im Tissue Engineering dar. Die Kultivierung von Zellen auf komplexen 3D-Trägern erfordert hohe Zellzahlen und lange Kulturzeiten. Um die Probleme des schnellen Mediumverbrauches und der limitierten Zellzahl bzw. Zelldichte in konventionellen Kulturmethoden zu umgehen, wurde ein neuartiges ?Zweikreis-Perfusionssystem? entwickelt. Das Grundprinzip besteht darin, dass ein kleinvolumiger ?Zellkultur-Kreislauf? (50-70 ml) über einen semipermeablen Hohlfaser-Bioreaktor durch einen großvolumigen ?Regenerations-Kreislauf? (1000 ml) kontinuierlich im Gegenstromprinzip regeneriert wird. Die Regulation des ph-Wertes und der Sauerstoffsättigung des Kulturmediums geschieht über einen integrierten, Druckluft-CO2-begasten Oxygenator. Während die Zirkulationsgeschwindigkeit (Durchflussrate) und Temperatur (37°C) im Regenerations-Kreislauf konstant gehalten werden, lassen sich diese Parameter im ?Zellkultur-Kreislauf? beliebig variieren. Das Inkubator unabhängige System erlaubt die simultane Kultivierung von bis zu 5 separaten Proben, welche über mikroprozessor-gesteuerte Ventile mit regeneriertem Medium versorgt werden. Es hat sich gezeigt, dass sich auf diese Weise ohne Mediumwechsel konstante und optimale Milieuverhältnisse in beiden Mediumkompartments einstellen lassen.
Zur Untersuchung der Wachstumseigenschaften von Zellen in diesem Perfusionssystem wurden osteoblastenähnliche Zellen auf eine zylindrische Matrix aus demineralisierter, GuHCl-extrahierter Rinderspongiosa aufgetragen. Unter intermittierender Perfusion kam es zu einem gleichmäßigen, intertrabekulären Wachstum der Zellen innerhalb des gesamten Trägers. Nach 6-8 Wochen konnte ein dichtes Netz ALP-positiver osteoblastenähnlicher Zellen innerhalb der gesamten Matrix beobachtet werden. Dabei scheint die physikalisch-mechanische Komponente der ?Umspülung? der Zellen mit dem kontinuierlich regenerierten Nährmedium einen positiven Einfluss auf das Anwachsverhalten und Proliferation der Zellen zu haben. Somit erlaubt das modifizierten ?Zweikreisperfusionssystem? nach den bisher vorliegenden Ergebnissen ein gute Möglichkeit für die Langzeitperfusionskultur in einem geschlossenen System mit individuell steuerbaren Strömungsverhältnissen im Zellkompartment bei einer kontinuierlichen Regeneration des Mediums.
In einer in-vitro sowie in-vivo Studie wurde die Effektivität von Thrombozytenkonzentraten (PRP) auf die Knochenneubildung im Vergleich zu BMPs untersucht.
Hierzu wurden knochenbildende Zellen aus dem Knochenmark von Ratten mit PRP in unterschiedlichen Dosierungen sowie BMPs inkubiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Applikation von Thrombozytenkonzentraten zu einer Steigerung der Proliferation der Zellen bei gleichzeitiger Inhibition der osteoblastären Differenzierung bewirkt. Während BMPs, wie auch autologes Blutplasma, zu einer massiven Steigerung der Aktivität der ALP und Mineralisation in-vitro führen.
Die in-vivo Untersuchungen bestätigten einen inhibitorischen Effekt der Thrombozytenkonzentrate bei der Knochenneubildung. Bei Implantation von Knochenmark alleine oder in Verbindung mit rhBMP-2 oder Plasma kam es zu einer deutlichen Ossifikation in der Oberschenkelmuskulatur von Nacktmäusen. Die Zugabe von Thrombozytenkonzentrat reduzierte die neugebildete Knochenmasse deutlich, sodass von einem inhibitorischen Effekt auf die Ossifikation ausgegengen werden muss.
Laufzeit: von 01.1999 bis 01.2001