Startseite: Forschungsbericht      Personenindex      Schlagwortindex      zugeh.Orgeinheit            Page in english      Impressum+Datenschutz   

Drittmittelprojekt

Titel:
Molekulare und funtionelle Analyse von zwei Synapsen-assoziierten Gehirnproteinen von Drosophila

Projektleitung an der Universität Würzburg:

Beteiligte Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler:

Kurzbeschreibung:

Forschungsschwerpunkte:

Die Feinregulation der synaptischen Übertragung ist von fundamentaler Bedeutung für alle Leistungen des Nervensystems einschliesslich Lernen und Gedächtnis. Im genetischen Modellorganismus Drosophila haben wir Gene kloniert, die für Proteine der präsynaptischen Endigung kodieren. Wichtige Funktionsaspekte der "cysteine string" Proteine (CSPs), die von uns entdeckt wurden, konnten durch Erzeugung von Null-Mutanten aufgeklärt werden. Nun wurden Mutanten für Gene möglicher Interaktionspartner der CSPs isoliert. Diese müssen charakterisiert werden. Die Bedeutung funktionsrelevanter Domänen der CSPs soll durch in-vitro-Mutagenesen analysiert werden. Ihre zellbiologische Funktion soll durch intrasynaptische Calciummessungen an transgenen Tieren mit selektiver Cameleonexpression untersucht werden.

Das Drosophila Synapsin-Gen (Syn) wurde ebenfalls von uns kloniert und molekular charakterisiert. Jetzt gelang es, gezielt Null-Mutanten im Syn-Gen zu induzieren. Die Analyse dieser Mutanten durch Elektronenmikroskopie, Elektrophysiologie und Verhaltensmessungen soll die Funktion der Synapsine in Drosophila aufklären. Die funktionelle Bedeutung der Phosphorylierung der Synapsine im Wildtyp und in transgenen Synapsin-Varianten soll in Kombination mit den verfügbaren Kinase-Mutanten untersucht werden.




Ergebnisse:

Cystein-string Proteine (CSPs) sind synaptische Vesikel-Proteine. Es wurde nachgewiesen, dass sie bei der regulierten Neurotransmitter- und Peptidfreisetzung beteiligt sind. Einige Domänen dieser Proteinfamilie sind vom Insekt bis zum Menschen konserviert, eine N-terminale Phosphorylierungsstelle, eine "J" Domäne, der "Cystein-string", eine "linker" Domäne zwischen "J" und dem Cystein-string, und eine C-terminale Domäne. Um die Funktion des Cystein-strings, des "linkers" und der C-terminalen Domäne im intakten mehrzelligen Organismus aufzuklären, haben wir verschiedene mutierte Gene konstruiert, die für Proteine mit modifiziertem oder eliminiertem Cystein-string, für eine Deletion in der "linker" Domäne, oder für eine Deletion von 27 C-terminalen Aminosäuren kodieren. Diese Genkonstrukte wurden in die Keimbahn von Drosophila Wildtyp und CSP Null-Mutanten transformiert um die biochemischen Eigenschaften des mutierten Proteins, die subzelluläre Verteilung und die Funktion in den transgenen Fliegen zu analysieren. Mutierte CSPs mit modifiziertem Cystein-String sind nicht in der Lage an Membrane zu assoziieren und sie konzentrieren sich nicht in den synaptischen Endigungen. Stattdessen verteilen sie sich homogen in allen neuronalen Kompartimenten. Entsprechend rettet die transgene Expression dieser Proteine in der Null-Mutante, unter der Kontrolle von wildtypischen Regulatorsequenzen, den Phänotyp der Null-Mutante nicht. Auf der anderen Seite beeinflusst eine Deletion in der "linker" Domäne oder dem C-Terminus die Fraktionierungseigenschaften oder die Verteilung von CSP im Gewebe nicht. Weiterhin genügt die Expression dieser letztgenannten mutierten CSPs in der Null-Mutante, um die temperaturabhängige Paralyse des Adulttieres und die verkürzte Lebensspanne, zwei bekannte Phänotypen der Null-Mutante, zu verhindern. Unerwarteter Weise, schaffen es diese Konstrukte jedoch nicht, die temperaturabhängige Paralyse der larvalen neuro-muskulären synaptischen Übertragung zu retten. Die Insertion eines B104 Transposons in Intron vier verändert die Menge der vier CSP Isoformen und führt zu einem hypomorphen Phänotyp. Wir schlussfolgern, dass sowohl für das richtige Protein-targeting, als auch für die richtige Proteinfunktion, eine intakte Cystein string Domäne im CSP-Protein vorhanden sein muss. Eine kleine Deletion in der "linker" Domäne und eine Deletion des C-Terminus scheinen die grundlegende Funktion von CSP in adulten Fliegen nicht zu beeinflussen.



Die synaptischen Proteine der Vertebraten-Synapsin-Familie binden an die Oberfläche synaptischer Vesikel, an ATP, und an Elemente des Cytoskeletts, inclusive den Actin-Filamenten. Man nimmt an, dass die Vertebraten-Synapsine die Neurotransmitterausschüttung regulieren. Abhängig vom Grad der Phosphorylierung kontrollieren sie den Vesikeltransportes zu den sog. release-sites. Weiterhin könnten sie auch an der Regulation der Synaptogenese beteiligt sein. Ein Drosophila-Homolog wird in fast allen synaptischen Endigungen exprimiert. Durch die Sequenzierung und Analyse der 5' Region des Drosophila Synapsin Locus konnte der mutmaßliche Promotor und ein zusätzliches Exon des Synapsin Genes identifiziert werden. Der Translations-Start wurde durch Proteinaufreinigung und Edman-Abbau bestimmt. Mittels "site-selected transposon mutagenesis" und P-Remobilisierung haben wir lebensfähige und fruchtbare Null-Mutanten erzeugt, die keine offensichtlichen Defekte in der Gehirnmorphologie und der synaptischen Ultrastruktur aufweisen. Elektrophysiologische Untersuchungen der synaptischen Übertragung am larvalen Nerv-Muskel-Präparat konnten bisher keine signifikanten Unterschiede zwischen Wildtyp und Synapsin-Mutante aufdecken. Es konnten jedoch bestimmte Verhaltensunterschiede registriert werden. Synapsin-Mutanten zeigen eine erhöhte Bewegungsaktivität, momentane Lern- und Gedächtnisdaten sind dagegen noch unschlüssig. Weiterhin ist der Paarungserfolg der männlichen mutierten Fliegen signifikant reduziert. Wir schlussfolgern, dass die Rolle der Synapsine im Nervensystem von Drosophila komplexer ist als bei Säugern.

Schlagworte:
    Drosophila
    CSPs
    Synapsin
    Protein-targeting
    Verhalten

Laufzeit: von 02.1998 bis 01.2000

Förderinstitution:
DFG ,Genehmigungsdatum: 26.01.1998

Publikationen: