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Drittmittelprojekt

Titel:
nterdisziplinäre Analyse pilzlicher Rhodopsine und ihrer physiologischen Funktion in Myzelien

Projektleitung an der Universität Würzburg:

Kurzbeschreibung:
Viele essentielle Prozesse in filamentösen Pilzen werden durch Licht gesteuert. Pilze besitzen von Natur aus
verschiedene Lichtsensoren, die auf ein breites Spektrum von Wellenlängen reagieren können. Grünes Licht
wird von pilzlichen Rhodopsinen rezipiert. Diese Membranproteine gehören zu den mikrobiellen Rhodopsinen,
die in den letzten Jahren aufgrund ihrer Verwendung in der Optogenetik an Bedeutung gewonnen haben.
Pilzliche Rhodopsine bestehen aus sieben Transmembranhelizes und enthalten das Chromophor Retinal, das
mit dem Protein kovalent durch eine protonierte Schiff-Base verbunden ist. Obwohl bekannt ist, dass pilzliche
Rhodopsine als lichtabhängige Protonenpumpen oder sensorische Proteine fungieren, fehlt bisher ein
detailliertes Verständnis der physiologischen Funktion und biologischen Rolle.
In diesem Projekt werden wir die molekulare Funktion und biologische Rolle ausgewählter pilzlicher Rhodopsine
analysieren. Wir werden eine Reihe biophysikalischer Methoden kombinieren, um die molekulare
Funktionsweise von Rhodopsinen aus den filamentösen Pilzen Neurospora crassa (Nop-1), Fusarium fujikuroi
(CarO, OpsA), Phaeosphaeria nodorum (PhaeoRD1, PhaeoRD2), Leptosphaeria maculans (LR) und Ustilago
maydis (UmOps1-3) zu charakterisieren. Wir werden pilzliche Rhodopsine heterolog in Säugerzellen oder Hefen
exprimieren und mit der Patch-clamp-Technik analysieren. Dabei werden wir uns auf die Art der transportierten
Ionen, die Pumpkinetiken, die Spannungsabhängigkeit, die Ionendurchsatzrate und auch auf die Eignung in
optogenetischen Anwendungen konzentrieren. Darüber hinaus werden wir einige pilzliche Rhodopsine isolieren
und Intermediate des Fotozyklus mittels Blitzlicht-Photolyse-Spektroskopie analysieren. Um erste Einblicke in
die biologische Rolle pilzlicher Rhodopsine zu erlangen, werden wir fluoreszierende Rhodopsine in Hyphen von
N. crassa, F. fujikuroi und U. maydis exprimieren und fixierte, mit Immunfluoreszenz gefärbte Myzelien mit
konfokaler (cLSM) und superaufgelöster Lokalisations-Mikroskopie (PALM/ dSTORM) eingehend untersuchen.
Wir werden pH-sensitive Farbstoffe in lebenden F. fujikuroi Hyphen verwenden, um lokale pH-Veränderungen
nach Aktivierung pilzlicher Rhodopsine zu beobachten. Um mögliche biologische Funktionen pilzlicher
Rhodopsinen herauszufinden, werden wir darüber hinaus die Wachstumsparameter verschiedener F. fujikuroi
Stämme (WT und Deletionsmutanten Rhodopsine/Lichtrezeptoren), die bei unterschiedlichen Licht- und
Nährstoffbedingungen kultiviert wurden, miteinander vergleichen.
Pilzinfektionen nehmen aufgrund des Klimawandels und der intensiven Landwirtschaft zu. Daher ist es sehr
wichtig, detailliertes Wissen darüber zu erlangen, wie Pilze auf ihre Umwelt, insbesondere auf Licht, reagieren.
Die Ergebnisse dieses Projektes können in langfristiger Perspektive dazu beitragen, die Entwicklung dringend
benötigter Fungizide zu unterstützen und/oder Wachstum von Pilzen in biotechnologische Applikationen zu
verbessern.

Schlagworte:
    Pilzliche Rhodopsine
    Filamentöse Pilze
    Patch-clamp
    Localisations-Mikroskopie

Laufzeit: von 01.2014 bis 01.2017

Förderinstitution:
DFG ,Genehmigungsdatum: 05.12.2013