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Drittmittelprojekt

Titel:
Anwendung von selenhaltigen Biokatalysatoren zu selektiven Oxidoreduktionen

Projektleitung an der Universität Würzburg:

Beteiligte Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler:

Kurzbeschreibung:
Subtilisin ist eine umfassend untersuchte Serin-Protease, welche die Hydrolyse oder Bildung von Peptiden, Amiden und Estern katalysiert. Das Enzym ist kommerziell verfügbar, zeigt hohe Stabilität, und die Reaktionen laufen mit hoher Stereoselektivität ab. Serin 221 im aktiven Zentrum von Subtilisin Carlsberg sowie Subtilisin BPN' wurde auf chemischem Weg in Selenocystein umgewandelt, wodurch die semisynthetische Peroxidase Seleno-Subtilisin entstand. Da die Substratbindungstaschen der ursprünglichen Protease und der gebildeten Peroxidase identisch sind, wurde vergleichbare Enantioselektivität beider Enzyme erwartet. In einer Seleno-Subtilisin-katalysierten kinetischen Racematspaltung sind zehn chirale Hydroperoxide untersucht worden. Die Enantioselektivitäten erreichten 99% ee der optisch aktiven Hydroperoxide; die bevorzugte absolute Konfiguration der Produkte entsprach der Arbeitshypothese.

In kinetischen Studien zeigte das semisynthetische Enzym mit einem nativen Enzym vergleichbare katalytische Effizienz und Enantioselektivität. Die Substrataffinität zu Alkylarylhydroperoxiden verhielt sich analog zur Affinität von Subtilisin zu Arylboronsäure-Inhibitoren. Dadurch ließ sich die Substratakzeptanz von Seleno-Subtilisin voraussagen.

Das im semipräparativen Maßstab synthetisierte und mit Glutardialdehyd quervernetzte Enzym erwies sich als äußerst stabil gegenüber erhöhter Temperatur (10 Tage bei 60°C) und organischen Lösungsmitteln (10 Tage in 50% DMF bei 40°C). Wiederverwendung im semipräparativen Maßstab war ohne Verlust an Aktivität oder Enantioselektivität bis zu zehnmal möglich.

In analoger Weise sind Seleno-Proteinase K, Seleno-Savinase, Seleno-Esperase und Seleno-Panstimase hergestellt und anhand umfangreicher Substratstudien charakterisiert worden. Unterschiede in der Enantioselektivität ließen sich auf die Größe bzw. Öffnungsweite der S1-Bindungstasche im Enzymgerüst der Seleno-Proteasen zurückführen. Die hieraus abgeleitete Hypothese, daß die Substratbindung im aktiven Zentrum der Seleno-Proteasen in unmittelbarer Nähe zur katalytischen Triade stattfindet, bestätigten 'molecular modelling' Studien. Die Geometrie der S1-Tasche und die Aminosäure His-64 spielen demnach eine entscheidende Rolle für die Struktur- und Stereoselektivität der Seleno-Proteasen.

Bei den mit Seleno-Trypsin und verschiedene Seleno-Lipasen sowie Glutathion-Peroxidase durchgeführten kinetischen Racematspaltungen erfolgte im übrigen keine chirale Erkennung von Alkylarylhydroperoxiden.

Schlagworte:
    Subtilisin
    Seleno-Subtilisin
    Semisynthetische Enzyme
    Kinetische Racematspaltung
    Selenocystein
    Peroxidase
    Enantioselektivität
    Stereoselektivität
    Hydroperoxide
    Glutathion-Peroxidase
    Seleno-Lipasen

Laufzeit: von 01.1996 bis 12.1998

Förderinstitution:
DFG ,Genehmigungsdatum: 01.10.1995

Publikationen:

Links:
Forschungsschwerpunkt